小RNA作用與應(yīng)用研究繼2001，2002連續(xù)兩年被美國Science雜志評為年度10大突破技術(shù)以來，近年來繼續(xù)熱度高漲，名列前矛。其核心技術(shù)RNA干擾(RNAi)，即用20多個(gè)核苷酸組成的短的雙鏈RNA(siRNA)代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域，不僅如此，它還為基因**開辟了新的途徑。此外，RNAi沉默機(jī)制的探索也取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。目前，在大致勾畫出生物體內(nèi)源性小RNA的重要作用框架后，進(jìn)一步闡述其作用細(xì)節(jié)、探索小RNA對細(xì)胞行為的調(diào)控、如何利用RNAi進(jìn)行**防治等等都成為生物學(xué)家研究的一大熱點(diǎn)。
1、RNAi的作用機(jī)制
通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs，siRNAs)。證據(jù)表明;一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，從而使啟動(dòng)子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理見(圖1)：
2.1.2、RNAi目標(biāo)序列的選取原則
RNAi目標(biāo)序列的選取原則應(yīng)遵循以下幾個(gè)方面的原則：(1)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)(untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列。
2.1.3、陰性對照
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。
2.2、siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer，E.coli，RNaseIII)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。
2.2.1、體外制備
2.2.1.1、化學(xué)合成
當(dāng)前，許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。
適用于：已經(jīng)找到有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于：篩選siRNA等長時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素
2.2.1.2、體外轉(zhuǎn)錄
以DNAOligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次
體外轉(zhuǎn)錄合成能足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長期研究。
2.2.1.3、用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和**(注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于：長時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因**
2.2.2、體內(nèi)表達(dá)
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。
2.2.2.1、siRNA表達(dá)載體
多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III啟動(dòng)子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNApolIII啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串(3到6個(gè))U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長期研究——帶有***標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便，而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長時(shí)間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列(其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作)。
2.2.2.2、siRNA表達(dá)框架
siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNApolIII啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNApolIII終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用**的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過SECs篩選出的有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(晶賽公司的Protocal可以解決這一問題)②不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選佳啟動(dòng)子不適用于：長期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了)
2.3、siRNA的轉(zhuǎn)染
將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：
2.3.1、磷酸鈣共沉淀
將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
2.3.2、電穿孔法
電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平(50%或更高)的毒性。2.3.3、DEAE-葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖**于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
2.3.4、機(jī)械法
轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍(biolisticparticle)。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。
2.3.5、陽離子脂質(zhì)體試劑
在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞?，F(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。
2.4、siRNA的高轉(zhuǎn)染效率需注意的幾點(diǎn)事為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，需要注意以下幾點(diǎn)：
1.純化siRNA在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。
2.避免RNA酶污染微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。
4.避免使用***Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用***。***會(huì)在穿透的細(xì)胞中積累**。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實(shí)驗(yàn)，以得到佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑針對siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞(同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。7.通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(配合標(biāo)記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞。
3、制備siRNAs或者dsRNA試劑盒的選取
長片斷的dsRNA可以在植物、原生動(dòng)物、昆蟲、線蟲中引發(fā)基因沉默。要研究這些對象，自己制備長片斷的dsRNA是很容易做到的：通過合適的質(zhì)粒亞克隆——線性化——體外轉(zhuǎn)錄的方法，就可以自己合成dsRNA。目前已經(jīng)有商品化合成dsRNA的試劑盒(例如NEB的HiScribeRNAiTranscriptionKit，后文介紹)。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，超過30nt的dsRNAs則引起非特異基因沉默。實(shí)驗(yàn)表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)特異的基因沉默有效的siRNAs是有19個(gè)堿基互補(bǔ)，兩邊3'端各有2個(gè)堿基突出(通常是UU，但是目前不清楚UU對siRNAs的活性影響有多大)的一對21-mer的dsRNAs。由于體外轉(zhuǎn)錄利用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增的時(shí)候，通常要求序列的首2個(gè)堿基為GG或者GA以提高合成效率，但是這兩個(gè)額外的堿基會(huì)大大降低siRNAs的活性，而且通常體外轉(zhuǎn)錄很難高效合成這么小的RNA(通常需在25nt以上)，因而早先哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi實(shí)驗(yàn)中用到的siRNAs是用化學(xué)方法合成的，方便，簡潔，不受堿基的限制?？墒遣还茉趺凑f，化學(xué)合成RNA的費(fèi)用是相當(dāng)高的(一個(gè)堿基要將近400元)，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中siRNAs的效率不一，一般一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)3—5對siRNAs以確定有效的，這樣的費(fèi)用就高了(就是6—10條siRNAs(每條21nt)，一個(gè)基因通?；ㄙM(fèi)不少于20000)。如果需要重復(fù)設(shè)計(jì)，在還有時(shí)間上的困擾?，F(xiàn)在，多個(gè)廠家推出了不同的試劑盒，一個(gè)試劑盒可以自行設(shè)計(jì)合成多個(gè)siRNAs，靈活性和可控性都明顯提高，不失為一種經(jīng)濟(jì)的選擇。例如在體外轉(zhuǎn)錄制備siRNA時(shí)，Silencer™siRNAConstructionKit——LowerCost&HigherPotencysiRNAsAmbion公司的這個(gè)試劑盒是建立在體外轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上的，其的設(shè)計(jì)有效克服了前面提到的難題，原理非常簡單：首先合成兩段29-mer的DNA作為模版(DNA合成的價(jià)格就便宜多了，即使是全球的DNA合成供應(yīng)商Operon，也就是7、8塊錢一個(gè)堿基)，包括8個(gè)與T7啟動(dòng)子引物3'端匹配的堿基(稱為引導(dǎo)序列，leadersequence)和21個(gè)設(shè)計(jì)的siRNA序列。將這兩個(gè)模版和對應(yīng)的T7啟動(dòng)子引物分別混合，引物末端和DNA模版褪火結(jié)合，用DNA聚合酶Klenow大片斷補(bǔ)平成為雙鏈DNA模版，分別用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物混合形成dsRNA，新的雙鏈RNA包含5'端單鏈的引導(dǎo)序列和中間互補(bǔ)的19個(gè)堿基序列以及3'端兩個(gè)重復(fù)的U(UU)。通過DNA酶降解模版，同時(shí)用單鏈專一的核酸酶消化5'的引導(dǎo)序列，由于RNase不能切開U堿基也不能切雙鏈RNA，所以得到的產(chǎn)物就是我們需要的21-mer的雙鏈siRNAs——有19個(gè)堿基互補(bǔ)，3'端各有2個(gè)U突出。通過試劑盒的純化小柱，去除引物、堿基鹽和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到的就是可以立即轉(zhuǎn)化用的siRNAs！
4、RNAi存在的若干問題及其前景展望
目前RNAi機(jī)制尚未完全闡明，尤其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究報(bào)道不多。siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制mRNA表達(dá)是有效的，但并不能象果蠅細(xì)胞那樣完全抑制目的基因的表達(dá)，可能是因?yàn)樯矬w是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，存在多種機(jī)制相互作用以調(diào)控基因的表達(dá)。另外，在哺乳動(dòng)物中，RNAi能否成功地抑制基因表達(dá)以及抑制的程度還取決于細(xì)胞類型。對線蟲來說，可以采用注射、浸泡或喂食的方法轉(zhuǎn)入dsRNA，而對哺乳動(dòng)物來說，尋找高效的方式來轉(zhuǎn)入siRNA以及快速的方式來篩選RNAi尚需進(jìn)一步探索。RNAi在抗病毒感染中的應(yīng)用令人振奮，但能否成功還無法保證。在研究中亦有諸多困難：(1)并不是所有的病毒RNA序列都能比較容易的接近siRNA，被識(shí)別、切割。有些病毒靶序列可能隱藏在二級結(jié)構(gòu)下，或者位于高度折疊的區(qū)域中，而有些病毒序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物，阻礙了與siRNA的識(shí)別。(2)病毒的復(fù)制過程并不嚴(yán)格，隨意性很強(qiáng)，因此往往產(chǎn)生突變的子代。這一特點(diǎn)能夠幫助病毒躲避機(jī)體的**監(jiān)控和**的抑制作用，同時(shí)也會(huì)干擾siRNA的識(shí)別。(3)在siRNA的導(dǎo)入問題上，同樣也面臨著技術(shù)上的困難。(4)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的RNA酶會(huì)降解siRNA，故怎樣保證siRNA的穩(wěn)定性仍是一個(gè)亟需解決的問題。盡管目前對RNAi的研究還不夠深入，RNAi還不夠完善，但這種現(xiàn)象在自然界是普遍存在且有效的，其應(yīng)用前景十分廣闊。它不僅能大大推動(dòng)人類后基因組計(jì)劃(蛋白組學(xué))的發(fā)展，還有可能設(shè)計(jì)出RNAi芯片，高通量地篩選**靶基因，逐條檢測人類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能，并且它還將應(yīng)用于基因**、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，用RNAi技術(shù)來抑制基因的異常表達(dá)，為**癌癥、遺傳病等**開辟了新的途徑。從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象至今，只有短短的幾年時(shí)間，但由于它的重要作用，使其成為生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn)。今后的研究應(yīng)主要集中于RNAi作用的機(jī)制及如何進(jìn)一步完善RNAi技術(shù)。
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